双光子显微镜是一项结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子同时吸收两个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子，其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜通常使用高能量锁模脉冲激光器（如钛宝石飞秒激光器）。

　　双光子显微镜具有很多优点：1）穿透力强，双光子显微镜采用长波长激发，容易穿透标本，穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍；2）对样本的光漂白和光毒性小，双光子显微镜只有在焦平面上才有光漂白和光毒性；3）光亮度和信噪比高。所以，双光子显微镜适用于长时间的观察活体细胞和组织，适合对厚的生物样品进行深层次的研究。